完整酶結構      郭瑞庭供圖

電子傳遞機制      郭瑞庭供圖

5月29日，《自然—通訊》在線(xiàn)發(fā)表了首個(gè)細胞色素P450酶的全長(cháng)精細三維結構，解答了這一數十年未解的科學(xué)難題。

湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗室教授陳純琪、馬立新和郭瑞庭合作完成了這項工作。他們解析了一種P450酶CYP116B46的晶體結構，并闡明電子在分子內傳遞的方式。這對了解P450的結構及完整機理提供了重要指導，且對P450酶在醫藥和工業(yè)領(lǐng)域的應用具有重要價(jià)值。

萬(wàn)能生物催化劑

細胞色素P450是一種酶蛋白，最早于1955年在老鼠的肝臟細胞中發(fā)現，因為其與一氧化碳結合的還原態(tài)吸收光譜波長(cháng)約在450 nm而得名。

該蛋白由血紅素（heme）結構域和含有黃素單核苷酸（FMN）的還原酶結構域組成；這兩個(gè)部分通過(guò)包含鐵硫簇的鐵氧還蛋白域相連。“細胞色素P450是一個(gè)龐大的酶家族，簡(jiǎn)稱(chēng)為CYP，參與許多天然產(chǎn)物的合成途徑與毒物、藥物代謝反應。”論文通訊作者陳純琪告訴《中國科學(xué)報》，在植物中，P450家族參與一些特殊化合物的合成，如青蒿素和紫杉醇；在人體中，P450家族主要參與解毒過(guò)程，如化解可以導致癌癥的黃曲霉毒素等。

這是因為P450的催化多能性很高，涉及20余類(lèi)反應，包括羥化反應、環(huán)氧化反應和成環(huán)反應等。其底物譜極廣，可以識別芳香族、聚酮類(lèi)、萜類(lèi)、肽類(lèi)、糖類(lèi)等類(lèi)型的底物，擁有“萬(wàn)能生物催化劑”之稱(chēng)。

它還具有高度區域選擇性和立體選擇性，能特異性的識別結構位點(diǎn)和方向。此外，P450酶的底物結合區具有高度可塑性，透過(guò)酶工程改造可以改變底物譜，在重要化學(xué)品和藥物制造方面的應用深具潛力。

因此，藥物活性化與代謝主要都是由CYP這個(gè)酶家族所負責的，大約囊括了生物體中此類(lèi)代謝的75%。

P450系統廣泛存在于所有生物甚至病毒中，已發(fā)現超過(guò)18000種P450系統。人體內已經(jīng)發(fā)現超過(guò)57種P450系統，大部分是膜蛋白，主要分布在粒線(xiàn)體內膜或內質(zhì)網(wǎng)上。不過(guò)，在大腸桿菌中未發(fā)現此類(lèi)酶蛋白的蹤影。

“絕大多數P450酶需要氧化還原酶來(lái)提供電子，以活化底物結合區的血紅素，進(jìn)而轉化底物。”陳純琪說(shuō)，建立一個(gè)P450系統必須尋找同源或者相匹配的氧化還原酶。

在P450系統的9個(gè)家族中，只有2個(gè)家族在同一條多肽鏈上自帶氧化還原酶，被稱(chēng)為自給自足的P450酶，這類(lèi)酶主要來(lái)自細菌。另外一些P450系統則需要從外界獲得匹配的氧化還原酶，這種情況主要發(fā)生在動(dòng)物體內。

“自給自足的P450酶在生物技術(shù)應用方面是極具吸引力的生物催化劑。因此，自給自足P450酶內部電子如何傳遞是一個(gè)非常有趣且重要的課題。”論文通訊作者郭瑞庭告訴《中國科學(xué)報》，此前，科學(xué)家已經(jīng)對P450系統中的血紅素和FMN等結構域研究比較清楚，但對中間連接部分始終不了解，缺乏全長(cháng)精細結構。

“在蛋白純化及培養晶體的過(guò)程中，P450酶極易從中間斷裂或降解，因而很難獲得完整的全長(cháng)三維立體結構。”陳純琪說(shuō)。

獲得全長(cháng)P450精細三維結構

目前已知的自給自足P450酶有兩類(lèi)。第一類(lèi)以來(lái)源于巨大芽孢桿菌的CYP102A1為代表，由氮端的血紅素結構域和碳端的P450還原酶 （CPR）組成，電子傳遞的方向是從碳端向氮端傳遞。雖然這類(lèi)P450酶的全長(cháng)精細結構仍然缺失，但對于這類(lèi)P450酶的電子傳遞機理也有了一些粗略的理論。

第一類(lèi)自給自足P450酶結構域排列      郭瑞庭供圖

第二類(lèi)是CYP116，該研究所涉及的CYP116B46就屬于這一類(lèi)。這類(lèi)P450由氮端的 heme結構域和碳端的鄰苯二甲酸二加氧酶還原酶類(lèi)結構域（PDR）組成，PDR包含了FMN-依賴(lài)的還原酶結構域與鐵氧還蛋白結構域。

第二類(lèi)自給自足P450酶結構域排列      郭瑞庭供圖

自給自足P450酶的一條多肽鏈內是如何將電子從碳端傳遞到氮端的血紅素的？由于30多年來(lái)長(cháng)期缺乏全長(cháng)的蛋白質(zhì)結構信息，在該項研究之前尚不清楚。

英國曼徹斯特大學(xué)化學(xué)生物學(xué)教授薩賓·L·弗利奇（Sabine L. Flitsch）說(shuō)：“獲得全長(cháng)酶是一項了不起的成就。”許多小組，包括她自己的小組，都試圖解析這些結構，因為它們作為生物催化劑具有重大的應用潛力。

“可以說(shuō)晶體制備已經(jīng)超越科學(xué)，幾乎成為一門(mén)藝術(shù)。”陳純琪說(shuō)，要想獲得一個(gè)完整的大蛋白晶體結構，其難度可想而知。

該研究所用的CYP116B46相對穩定，加上郭瑞庭長(cháng)年從事晶體制備和結構解析工作積累的豐富經(jīng)驗，他們得以利用X射線(xiàn)晶體學(xué)對其完整的晶體結構進(jìn)行解析。

結構分析表明，在這種酶中，FMN足夠接近鐵硫簇以實(shí)現直接電子轉移；但血紅素離鐵硫簇太遠，不允許電子直接轉移，而是依靠5個(gè)“二傳手”氨基酸實(shí)現傳遞。

“我們解析了來(lái)源于CYP116B46全長(cháng)的晶體結構，且建立了清晰的酶結構模型。”郭瑞庭說(shuō)，這條連續性的多肽折疊成三個(gè)結構域，由兩段連接肽相連，從氮端到碳端依序為：血紅素結合域、還原酶結構域和鐵氧還蛋白結構域。

郭瑞庭介紹，結構解析后發(fā)現，CYP116B46三個(gè)結構域的排列與電子傳遞的方向竟然非常一致。血紅素結合域的底物結合區朝向外，有利于底物進(jìn)入結合，這顯示結構的排列相當合理。其中，還原酶結構域和鐵氧還蛋白結構域的直線(xiàn)距離為7.9Å，有利于電子的直接傳遞。

“科學(xué)家普遍認為，小于8 Å的距離是電子可以直接傳遞過(guò)去的。”郭瑞庭說(shuō)。

另一方面，鐵氧還蛋白結構域和血紅素的直線(xiàn)距離達25.3 Å，超過(guò)目前認定的有效直接電子傳遞距離。

5個(gè)“二傳手”傳遞電子

“在這兩個(gè)氧化還原中心之間，由其他輔助因子來(lái)幫助電子傳送的可能性較低。”郭瑞庭解釋說(shuō)，因為結構顯示二者之間的通道狹窄，缺乏其他輔助因子結合的特征。另一方面，考慮到氨基酸也是一種電子載體，所以二者之間的氨基酸也有可能在電子傳送的過(guò)程中扮演重要角色。

“現在我們有機會(huì )設計還原酶結構域和電子轉移途徑。”陳純琪說(shuō)。

為了分析這些氨基酸的側鏈基團對于CYP116B46酶活性的影響，他們將這些位點(diǎn)分別突變成丙氨酸，并進(jìn)行產(chǎn)物生成量的測定來(lái)評估每個(gè)氨基酸扮演的角色。

郭瑞庭介紹，酶活測試結果顯示，R388、R718、E723、S726和E729的丙氨酸突變體活性明顯下降。將這些位點(diǎn)再次標定在結構上，可以看出大致的電子傳遞方向。

R378A突變體蛋白質(zhì)缺乏血紅素造成的紅色，一氧化碳處理后也沒(méi)有出現吸收峰帶移的現象。加上R378的所在位置鄰近血紅素，推測R378可能與結合血紅素相關(guān)。因此，R378A的突變造成的效應更加復雜，需要進(jìn)一步實(shí)驗才能判斷此一位點(diǎn)對于CYP116B46電子傳遞的影響。

[2Fe-2S] 與heme通道的氨基酸突變驗證         郭瑞庭供圖

“知道了氨基酸在電子傳遞過(guò)程中扮演的角色之后，我們就可以考慮尋找替換別的有效氨基酸，提高電子傳遞效率。”郭瑞庭解釋說(shuō)，這就好像換上一個(gè)手更長(cháng)的“二傳手”，讓電子能更快的傳遞過(guò)去。

這種設計將提高催化反應的效率。P450全長(cháng)結構的解析，對于了解自給自足P450酶催化機理是一個(gè)非常重要的里程碑，對于P450酶改造與應用更具有重要的指導意義。

相關(guān)論文信息：https://doi.otg/10.1038/s41467-020-16500-5